引言
2009年，Hans Clevers和其实验室的博士后Toshiro Sato用来源于小鼠肠道的成体干细胞培育出首个微型肠道类器官，掀起了类器官研究的热潮。2011年，Sato等运用类器官技术率先建立了肿瘤类器官，他们是在小鼠结肠隐窝的培养条件的基础上，通过调整培养环境诱导小肠和结肠的类器官，再通过进一步优化调整，从结肠腺瘤和腺癌及Barrett食管中建立肿瘤类器官模型。癌症患者来源肿瘤类器官模型的建立，被认为是类器官培养技术的又一重大突破。肿瘤类器官是将患者肿瘤组织分离获得的肿瘤细胞（含有肿瘤干细胞）在加入一定的细胞因子和小分子建立类似体内的微环境中进行3D培养，形成微型肿瘤模型，其具有与来源肿瘤组织相似的结构特征和功能特性, 而且能够在体外3D培养体系中稳定扩增，它可模拟体内肿瘤特征及肿瘤细胞异质性，该技术的建立为癌症研究和治疗提供了可靠的模型，特别是为个性化癌症治疗开辟了新的视野。

目前，科研人员通过优化各种培养条件成功构建了许多肿瘤类器官，包括结肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌、宫内膜/卵巢癌、子宫癌肉瘤、尿路上皮癌和肾癌等。与传统肿瘤研究模型相比，肿瘤类器官可以最大程度地模拟肿瘤在体内的结构和功能，既能直观展现肿瘤生长的过程，又能反映患者个体差异，是一种直观、可靠、高效和避免伦理争议的器官水平研究体系，更加适合于体外的肿瘤生物学和治疗相关的研究。肿瘤类器官的培养相较于正常类器官更加复杂，培养周期更长，在培养过程中遇到的问题更多，BioGems小编白小姆根据文献总结以及实际操作的一些经验整理出以下要点，以供大家参考。


Chapter 1 取材篇
1） 取材时要区分正常组织和肿瘤组织，在提取肿瘤组织时，要尽量提取富含血管（呈现粉红色）和含有上皮细胞的部位，剔除坏死组织（黄色或黑色）、脂肪以及肌肉组织。

2） 剔除后的肿瘤组织应留取部分进行冻存，可用于免疫组化切片和分子生物学实验（和培养后的肿瘤类器官进行对比鉴定）。

3） 剔除后的肿瘤组织剪碎后需要进一步进行消化解离，可以参考对应的正常组织的消化液，一般由胶原酶、胰酶、DNA 酶和透明质酸构成；消化条件为37℃恒速水平摇床下消化，时间不超过1h，可在消化中途取上清液在镜下观察，如果出现3-10个的细胞团形成，则停止消化。

4） 样本取下后若不能及时处理，应放入对应的组织样本保存液中。如果需要低温运输保存，可在保存液中额外添加10μM的Y-27632，可一定程度上减少肿瘤干细胞的凋亡。条件允许的话，最好还是用新鲜取材的样本做肿瘤类器官培养，新鲜的样本建系成功率高。

5） 如果原位取材建系失败，可考虑取转移灶中的肿瘤组织，或者分选循环肿瘤细胞进行诱导培养。

Chapter 2 种板培养篇
1） 肿瘤类器官的培养需要在3D环境中进行，维持3D培养用的基质胶推荐用Corning的Matrigel（货号#356231），该基质胶是文献报道中应用最多的。

2） 细胞种板密度的参考：越来越多的研究揭示肿瘤类器官是由肿瘤组织中的干细胞（肿瘤干细胞）形成，因此种板细胞中的肿瘤干细胞是肿瘤类器官形成的种子细胞，而肿瘤干细胞在消化后的肿瘤组织悬液中比例极低，这就要求我们种板的密度不能太低，但是太高的种板密度会导致由过多的其它肿瘤细胞凋亡引起的肿瘤类器官培养失败。我们建议进行不同细胞密度梯度预实验来摸索最佳的种板密度。

3） 肿瘤类器官培养基成分的确定：诱导培养基是在基础培养基DMEM/F-12中添加各种因子,而这些因子组分是肿瘤类器官形成的关键，由于肿瘤组织存在基因突变的个体差异，同种肿瘤类器官其诱导因子也有可能不尽相同，这就导致了市面上很难有某一种稳定的肿瘤组织类器官培养基，因此绝大部分进行肿瘤类器官研究的科研人员都是自己摸索调试培养基中添加的各种组分因子，这些组分因子一般都会包含以下四类：

• Wnt 信号通路激活剂；
• 酪氨酸受体激酶的配体，刺激上皮细胞增殖；
• TGF- β信号通路抑制剂，抑制上皮细胞分化；
• ROCK 抑制剂，保持干细胞多能性。

PeproTech及其旗下品牌BioGems可以提供类器官培养用的几乎所有细胞因子和小分子，产品质量稳定，每年都有海量高分文献发表。

Chapter 3 防污染篇
1）肿瘤组织样本在取材以及运输过程中可能会引起污染，这就要求我们在取材源头上就要注意可能带来的污染，同时样本应当放在含有双抗的组织运送液中，在微生物阳性区域采集的样本除了要加入双抗外，还需要额外添加其他抗生素，例如Primocin（原代细胞抗生素）、vancomycin（万古霉素）、gentamicin（庆大霉素）等。

2）组织处理过程要注意无菌操作，组织消化时也可以在消化液中加入抗生素防止污染。

3）在培养过程中如果出现污染，应首先弃去孔内培养基，加入5M NaOH到孔内静置1h，吸走弃之，再加入70%乙醇清洗污染孔，并更换培养皿的盖子。

Chapter 4 传代消化篇
1）弃去培养基后，加入预冷基质胶回收液吹打基质胶，将培养孔内的基质胶全部回收后离心，弃去胶回收液，加入Tryple消化液进行消化，一般消化10-15min，期间可在镜下观察，若类器官团块大部分解离为3-10个的细胞团时，则停止消化。

2）消化后细胞进行传代，此时的细胞含有大量的肿瘤干细胞，消化后的每个细胞小团块都可能会形成类器官，可根据之前收获类器官时培养孔内类器官的生长个数和大小综合考虑传代密度，一般以第一代的肿瘤类器官种板密度达到20-30%为宜。

3）如果需要做药敏实验，一般建议选择第一代或者第二代的肿瘤类器官进行，传代次数越多，发生基因突变的概率越高。

Chapter 5 肿瘤类器官鉴定篇
肿瘤类器官的鉴定可以参考Hans Clevers最早关于乳腺癌类器官的报道；该文章从组织病理学进行形态结构观察（细胞水平）、肿瘤标志物的染色鉴定（蛋白水平）、基因表达变化及基因突变分析（基因水平）、药敏活性测试（功能应用）这四个层面鉴定了乳腺癌类器官。

总结
尽管肿瘤类器官技术前景广阔，但仍有很多困难亟待解决，其中之一就是该模型中肿瘤微环境的缺乏，如基质细胞、免疫细胞、神经和血管内皮等，使其不能完全表现出肿瘤在体内的发生发展的全部特征。如何在体外培养体系中重建肿瘤微环境，将是未来研究的一个方向。另外，类器官培养体系含有各种成分，可能对实验结果造成不确定的影响，其培养技术尚未成熟，培养条件复杂；更简单、髙效的培养方案仍需进一步摸索。我们坚信类器官作为具有广阔应用前景以及独特优势的技术，在广大科研人员更多的时间和精力的投入下，将是未来转化医学不可或缺的基石。

参考文献
1.Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.
Else Driehuis, Kai Kretzschmar & Hans Clevers，Nature Protocols 2020, 15:3380-3409


2.A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.
Norman Sachs, Hans Clevers, Cell, 2018,172(1/2):373-386.


3.Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.
Fleur Weeber, Emile E Voest,Cell Chem Biol,2017 Sep 21;24(9):1092-1100


更多的产品和技术咨询请联系我们：BioGems China
电话：0512-6856 7071
企业QQ：80017 7071
邮箱：china@biogems.com