Fc受体与流式染色

FcR(Fc受体)是一类能够和抗体Fc片段特异结合的细胞表面蛋白，不同类型的细胞可以表达不同类型的FcR，对应和不同结构类型的抗体相结合，而流式染色用的大多是IgG类型的单克隆抗体，其结合的Fc受体为FcγR，根据与抗体Fc片段亲和力的强弱可将FcγR分为三个亚家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。

FcγRI主要表达在单核细胞、巨噬细胞和DC细胞以及活化的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。FcγRII有三种形式，FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc，FcγRIIa主要在中性粒细胞、单核细胞、DC细胞表面表达；FcγRIIb主要在髓系细胞和B细胞表面；FcγRIIc 主要在单核巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞表面表达。FcγRIII 在体内有FcγRIIIa和FcγRIIIb两种亚型，和IgG的结合力分别为中度和低亲和力，FcγRIIIa几乎在所有白细胞中表达；而FcγRIIIb主要在中性粒细胞中表达。

在流式染色过程中，如果我们需要染色的细胞高表达Fc受体，那么在抗体染色的过程中，抗体的Fc段会与细胞表面的Fc受体进行结合，从而产生非特异性的染色背景，最终导致流式实验结果出现假阳性。那么在流式染色过程中如何避免这类结果的出现呢？

图1：左边图只有抗体与Fc受体结合产生的信号，属于假阳性；右边图抗体与抗原和Fc受体都有结合，染色阳性。

方法一：可通过Fc受体阻断剂（Fc受体抗体），在流式染色抗体加入之前，先加入Fc受体抗体孵育细胞，将细胞的Fc受体占据，这样后续加入的流式染色抗体就就很难与Fc受体结合了。当然，并非所有的流式染色都要加入Fc受体阻断剂，一般我们只针对表达Fc受体的细胞并且染色出现异常考虑使用。此外，对于人类细胞的染色，Fc受体的阻断并不是特别重要，因为流式抗体（动物来源的单克隆抗体）与人细胞的Fc受体结合效率很低，如果特定情况下出现染色背景，可以考虑使用染色抗体来源物种的血清孵育细胞，或者用人AB 型血清对细胞进行孵育，这样会明显地阻断单克隆抗体的非特异性结合。

图2：上图通过加入Fc受体阻断剂，可抑制染色抗体与Fc受体的结合

方法二：可通过用同型对照，此时需要留一管细胞加入同型对照抗体（与流式染色抗体相同种属来源，相同亚型，相同标记，相同使用量），我们流式染色管的结果只需以同型对照染色管的结果为阴性参照。加入的同型对照抗体会和细胞表面的Fc受体结合，如果加入的流式染色抗体能产生大于同型对照染色的信号，则说明流式染色结果是阳性的。

图3：左图为Fc受体染色背景，中图流式抗体染色结果为阴性，右图流式抗体染色结果为阳性。

除了考虑Fc受体的影响外，在活细胞的表面染色中，单核细胞和巨噬细胞均存在吞噬抗体或荧光素发生非特异性结合的现象，这个时候尤其需要做好相应的对照来排除假阳性染色。

细胞因子是由免疫细胞（淋巴细胞、单核-巨噬细胞等）和相关细胞（成纤维细胞、内皮细胞等）产生的调节细胞功能的高活性多功能多肽或蛋白质分子，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用。不同哺乳动物在进化过程中其分泌的细胞因子氨基酸序列存在差异，这就告诉我们在进行实验时需要选择对应种属的细胞因子，然而世界上的物种丰富多彩，从无脊柱动物到脊椎动物都可能有细胞因子的表达，而且各种动物都可能成为生物学家的研究对象，有时需要特定动物，如牛、狗、猫、鱼等的细胞因子来做实验，但是商品化的细胞因子多数是重组人、大鼠或小鼠的，针对特殊物种的重组细胞因子很难买到。那么如何确定重组人、大鼠或小鼠的细胞因子是否能用于培养特殊动物来源的细胞呢？这就需要我们来判断种属之间的交叉反应！我们推荐通过以下途径来获得信息。


在PeproTech的官方网站进行查询，具体方法为：

1.在浏览器的地址栏输入：www.peprotech.com；

2.根据产品名称(如Recombinant Human VEGF165 )或产品编号(Cat#100-20)找到您需要了解的细胞因子；

3.点击该细胞因子的链接，向下翻动页面，找到“Cross Reactivity Cited in References (引自文献的交叉反应)”栏；

4.在“Cross Reactivity Cited in References (引自文献的交叉反应)”栏，可看到Recombinant Human VEGF165(Cat#100-20)已应用的种属，如鸡(Chicken)、牛(Cow)、豚鼠(Guinea Pig)、马(Horse)、人(Human) 、猪(Pig) 、兔(Rabbit)、大鼠 (Rat) 羊(Sheep)、鳟鱼(Trout) 和斑马鱼(Zebra Fish)等(见下图1)。

5.点击相应种属链接如鳟鱼(Trout)(如上图一红色箭头所示)，即可查得对应参考文献(见下图二)。

如果您感兴趣的种属暂时没有对应的参考文献，您也可以使用PubMad的BLAST工具，将已知种属细胞因子的氨基酸序列与PubMad数据库中您感兴趣的种属蛋白序列进行同源比对。一般来说，不同种属之间蛋白同源性（序列一致性）高于80%以上的基本上就可确定为有交叉活性，可推荐使用。我们以比对Recombinant Human EPO(Cat#100-64)与PubMad数据库中牛的EPO同源性比对为例，进行示范。

1.首先打开PubMad主页(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)，向下翻动页面，找到BLAST入口(如下图三)。

2.在Web BLAST栏选择Protein BLAST(如下图四)。

3.在PeproTech官网输入100-64，点击该产品链接，找到Recombinant Human EPO的氨基酸序列(如下图五)。

4.将该氨基酸序列，复制粘贴至氨基酸序列框(如下图六)。

4点击BLAST按键进行比对(如下图七)。

5比对过程较慢可稍等片刻。此时比对的是数据库中的所有种属，可在筛选栏限定您感兴趣的种属进行查询。如在Organism栏输入Bos Taurus(牛的拉丁文名称)，点击Filter键进行筛选(如下图八)，即可迅速找到与牛EPO比对的Per Ident值为83.23％(如下图九)。说明已知的Recombinant Human EPO可以尝试应用于牛细胞培养。

注：筛选时一般需使用物种的拉丁文名进行限定，可根据下表一进行查询。

表一：物种中文与拉丁文对照表

PeproTech的所有细胞因子和蛋白均为冻干粉，这使得运输非常便捷，常温条件即可。而且，细胞因子和蛋白冻干粉非常稳定，在-20℃或-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，然后以液体形式加到培养体系或注射入动物体内。溶解步骤非常关键，溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活，这也是很多用户在实际使用中经常遇到的问题。

那么，应该如何进行正确的溶解呢？

下面我们以Recombinant Human IL-4 (重组人IL-4，产品编号：200-04)的说明书为例，对细胞因子或蛋白的溶解方法进行详细的阐述。
拿到重组人IL-4的说明书后，您会发现有一段关于Reconstitution(重悬)的叙述，这段内容含有溶解相关的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening
第 1 步：开盖前离心试剂管
PeproTech的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中，为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而飘散并粘贴于管壁或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。
有很多用户会问一个问题，即应该用多少转速、多长时间离心试剂管，才能达到良好的收集效果？
答：有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个Spin键，按了此键后，离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到最高点后速度即刻下降，直至停止旋转，整个过程大约30s。这个Spin键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。但有些实验室没有这样的高速离心机，只有最高转速为4000-4500rpm的离心机。这种情况下，需3000-3500rpm离心5min，也能达到类似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.
第 2 步：用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振荡。
这个步骤即为溶解步骤，非常重要。

1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉
用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人IL-4需用水溶解，而重组人IL-2 (产品编号：200-02)则需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重组人TGF-beta1 (产品编号：100-21)需用10mMCitric Acid (柠檬酸)，pH3.0溶解，重组人FGF-basic(产品编号：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重组人FGF-10(产品编号：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸钠)，pH7.4溶解，重组IL-13(产品编号：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重组细胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的叙述仅供参考。具体应该如何溶解应以相应批次的官方说明书为准)。后续的文章中将对各种溶解液的配制方法进行详细的阐述，望继续关注。

经常有用户会问，为什么会有这么多种溶解方法？
答：我们知道，蛋白的溶解性与很多因素有关，其中比较重要的是pH值和离子强度。PeproTech的细胞因子或重组蛋白在出厂前均经严格测试，说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH值和离子强度与说明书中所标明的不符，很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解，这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。

有不少用户没注意说明书上的描述，而是根据习惯，直接用PBS或培养液(1640或DMEM等)等溶解细胞因子或蛋白的冻干粉。这样做可以吗？
答：有时可以，要看具体情况。PeproTech的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是PBS，此时千万不能用PBS或培养液直接来溶解，具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子，如重组人KGF(产品编号：100-19)和重组人FGF-23(产品编号：100-52)等，说明书上的溶解液即为1x PBS，此时用PBS溶解完全没问题，那么用培养液溶解也是可以的，不过最好还是用先用PBS溶解，然后再用培养液稀释。

2) 一定要溶解到指定的浓度。

蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围，该例为0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6(产品编号：100-30)为0.5-1.0mg/ml，而重组人Activin B(产品编号：120-15)则一定要是0.5mg/ml。

高于或低于该浓度范围会有什么问题呢？

答：首先，细胞因子或蛋白会不稳定，即很容易出现活性下降的现象。其次，高于这个浓度范围，可能会超过该蛋白的最大溶解浓度，即蛋白无法完全溶解。再者，高于或低于该浓度范围，蛋白可能会出现聚集(aggregation)，最终结果还是部分蛋白未溶解，导致蛋白活性的减弱。

3) 一定不能振荡(vortex)。
这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。

有用户会问，若想保证溶解液与冻干粉充分混匀，以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解，该怎么办呢？
答：多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的，一般我们用移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子或重组蛋白完全溶解。

对于不易溶解的细胞因子或蛋白，PeproTech会在说明书中进行备注(Note)。如在重组人IL-13(产品编号：200-13)的说明书中您会看到：Slow to dissolve (缓慢溶解)，在重组人IL-11(产品编号：200-11)的说明中会看到： This solution is slow to dissolve.(该溶液溶解缓慢)。这种情况下，您最好能将要溶解的细胞因子或重组蛋白放在水平摇床(shaker)上低速摇一段时间，促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。有些蛋白，如重组人IL-13 Variant (产品编号：200-13A)虽然难溶，但却不需用摇床来加速溶解。其说明书上的备注为：Allow the reconstituted vial to sit at 4oC for at > 2 hours before use. (将重悬液在4oC静置2小时以上)

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1 week.
第 3 步：该重悬液在 2-8℃ 最长可保存 1 周。
用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后，细胞因子或重组蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在这种条件下，细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持1周。这对一个周期为5-7天的实验，如DC(树突状细胞)的诱导成熟是足够的。在此期间，只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。
其实，说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在4℃保存，待1周内用完。如进行稀释，必须遵照下面第4步的方法，即需用含载体蛋白的溶液进行稀释，否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易会粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降，细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃.
第 4 步：如要长期保存，则需用含载体蛋白 ( 如 0.1% BSA ，或 10% FBS ，或 5% HSA) 的溶液进一步稀释，然后分装冻存于 -20℃ 至 -80℃。
如果一个实验周期长于一周，或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完，我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法是：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液将重悬液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃，即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。

经常有人会在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后直接分装冻存于-20℃至-80℃，这样可以吗？
答：不行。我们知道，塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用，也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很难与管壁分离的。做过ELISA实验的人都知道，ELISA的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶标板上的。
载体蛋白，如1% BSA，10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点，使细胞因子或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释，而直接分装冻存，则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上，导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白的浓度大为降低，最终表现为细胞因子或重组蛋白活性的下降。 因此，在分装冻存前，一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。 稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度，因大量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。

那么，含载体蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以吗？
答：水不可。该溶液通常是指pH近中性，有一定缓冲能力的缓冲液，如PBS，培养液(RPMI1640, DMEM等)等。

还有一个经常被问及的问题，即在做无血清培养或动物的体内实验时，细胞因子中不能含有BSA，FBS或HSA等动物或人的蛋白，要想长期保存细胞因子或重组蛋白该怎么办呢？
答：一种方法是订购PeproTech的小包装(size A)细胞因子或重组蛋白，每次使用一只，用后即废弃。如觉得该方法过于浪费，则可用海藻糖(Trehalose)作为载体，用含海藻糖的溶液来稀释已重悬的细胞因子或重组蛋白，然后分装冻存。

总之，为保证细胞因子或重组蛋白冻干份在重悬后仍能保持良好的生物活性，必须按照说明书中 Reconstitution 的方法严格操作。

Q1：收到产品后如何处理?
A1：产品在运输过程中由于颠簸，导致部分产品会粘附在管壁或盖子上。我们推荐根据购买的小分子规格进行如下选择：
1）如果规格小于10mg，建议一次性溶解，由于小分子的容器为玻璃瓶，对其进行离心很不方便，因此我们应该关闭超净台风机，打开盖子，根据说明书推荐的溶解浓度加入对应体积的溶剂，用移液管反复吹打管底和管壁，盖上盖子后再颠倒混匀溶解可能残存在盖子上的粉末；
2）如果规格大于10mg，在有精密天平的条件下，可以称取一定质量的粉末（可用EP管先调零天平，再加入粉末，最后称取质量），根据称取的质量加入相应体积的溶剂进行溶解。

Q2：化合物用什么溶解？
A2： 溶剂的选择请参照产品说明书。很多小分子试剂不能直接溶解于水、PBS缓冲液或者生理盐水，可以先用DMSO或乙醇配制储存母液。储存母液通常能够长期保存，并且可以用水性溶剂稀释到体内外实验所需的浓度。通常，小分子产品在这些有机溶剂中的溶解度足够高，可以使用水性溶剂按1:500到1:1000稀释到其工作浓度。一般认为，少量的有机溶剂（例如0.1% DMSO）不会影响生物实验，但是最好建立一个溶剂对照组，以排除溶剂的非特异性影响。

Q3：说明书注明化合物在特定浓度可以溶解，但化合物还是没有完全溶解，怎么办?
A3：有时需要使用一些辅助溶解的方法，如水浴加热45℃以下，20-30min左右；或者用超声波震荡，15min左右，通常这样处理后化合物都能够完全溶解。如果这样还不能完全溶解，请联系我们技术支持获取更多的帮助。

Q4：如何对工作液进行灭菌?
A4：由于市售的大部分小分子都没有做无菌工艺处理，因此在使用小分子时需要考虑除菌，对于使用DMSO溶解的，因为DMSO本身有很强的杀菌能力，可认为配制好的溶液即为无菌溶液，对于用其它溶剂溶解的小分子可用0.22μm滤膜（有机溶剂专用滤膜）进行过滤除菌。请勿使用紫外、射线或者高压蒸汽灭菌方式，否则可能破坏小分子试剂的化合物结构，影响其活性。

Q5：产品的储存条件是什么？
A5：我们产品说明书上会明确表明该产品的具体储存条件和注意事项，请按照说明书进行保存。建议参照说明书和实验需求，选取合适的溶剂配制母液（DMSO，水，乙醇等）。通常，母液至少是工作液浓度的1000倍以上，分装后放-20℃或者-80℃保存，避免反复冻融。大部分小分子的母液在-20°C下能保存3-12个月，5次以内的反复冻融不会明显影响产品的生物活性。此外，有部分产品溶液不稳定，需要现用现配。对于这些产品，您需要在使用前配制溶液，并在24小时内用完。

Q6：冻存试剂可以室温或37℃水浴解冻吗？
A6：冻存试剂的解冻，建议在冰水浴或者冰浴条件下缓慢解冻。如果时间比较着急，大部分冻存的试剂可以在室温或者37℃水浴解冻，但是需要小心观察，边晃动边溶解，等到试剂部分溶解后，即需从水浴中取出，确保溶解过程中试剂还是接近0℃的。解冻后的试剂可以置于冰水浴或者冰浴中。

Q7：产品未经过灭菌处理能否用于细胞实验?
A7：产品不是无菌状态的，不能保证产品不会污染您的细胞，但是以下几条防范措施可以有效避免细胞污染：
1）培养基必须含有青霉素、链霉素等抗生素，它们能够有效避免绝大多数细菌污染；
2）使用纯DMSO或者乙醇溶解小分子产品，它们有一定的灭菌能力；3）整个实验过程在无菌条件下完成。

Q8：细胞实验剂量及处理时间如何选择？
A8：建议根据实验室前期的实验结果，同时结合相关的参考文献确定合适的浓度和作用时间；除参考文献外，还需要通过浓度梯度预实验做“剂量-效应”曲线确定最佳作用浓度；通过时间梯度预实验做“时间-效应”曲线确定最佳作用时间。如果没有前期实验结果，也没有相关文献报道，则建议您选择相关的细胞株或者是相关实验目的的其他文献，选择较宽的浓度范围做浓度梯度预实验。同时，小分子试剂的使用量受多种因素影响，比如作用细胞的通透性，可接触性，孵育时间，细胞种类，传代次数等。另外，需要设立溶解小分子试剂时所采用的溶剂作为对照，以排除溶剂的非特异性影响。

Q9：在动物实验中如何使用小分子产品？（如给药途径、剂量、溶剂以及给药周期等）
A9：建议用双蒸水或PBS缓冲液稀释到实验所需的浓度。若是用DMSO配制的储备母液，为减少对动物的毒性，建议 DMSO 的终浓度不要大于2% 。有些产品在水中的溶解度较低，导致DMSO母液在稀释时析出的，可以通过添加助溶剂来帮助溶解，比如吐温-80、Solutol、甘油、卵磷脂和聚乙二醇等。在动物给药实验中，要综合考虑小分子试剂在体内的实际分布与给药方式（口服、腹腔注射、静脉注射，肌肉注射，皮下注射等）、药物利用率，半衰期，清除率，受体结合量，分布容积等等紧密相关。特定组织或器官吸收试剂的量也往往比分离的细胞吸收量少。

Q10：如果所做动物实验完全没有文献参考剂量怎么办？
A10：如果没有直接的文献支持，建议查找与自己实验体系接近的文献，比如该小分子试剂在其他动物模型上的剂量、在其他实验目的的剂量等，还可以根据不同实验动物的体表面积进行等效剂量的转换。通过综合考虑得到一个初步的剂量，然后做小规模的预实验进行剂量的优化。动物实验还要考虑给药方式，给药间隔，给药范围，给药体积，以及该小分子试剂的耐受剂量范围，配制药液的稳定性，该小分子试剂的溶剂是否需要等渗等问题。