抗体的选择以及不同应用场景

一、抗体的结构

抗体是免疫系统在抗原刺激下，由浆细胞生成，能与相应抗原产生特异性结合并介导免疫效应的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）。Ig的基本结构是通过二硫键连接的两条轻链和两条重链。根据重链的类型（α、δ、ε、γ和μ）可将Ig分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中，IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，约占75%。

以IgG为例，抗体由四条肽链组成，表现为典型的“Y”字型结构。每条肽链分为可变区（V区）和恒定区（C区）。V区位于肽链的N端，由轻链VL与重链VH组成，直接参与抗原的结合，决定抗体的特异性（即靶标）。C区位于肽链的C端，轻链CL和重链CH1-CH3维持抗体结构的稳定性。其中两条重链的CH2-CH3区域又被称为Fc片段（可结晶段），可与免疫细胞表面受体或补体蛋白结合，触发相应功能。重链的VH-CH1与轻链共同构成Fab片段（抗原结合段）。Fc段是进化中相对保守的氨基酸序列，决定抗体的种属信息。木瓜蛋白酶作用于重链间二硫键近N端侧，生成2个Fab片段和1个Fc片段。

图1 抗体结构示意图（doi: 10.1080/08820139.2020.1775643）

二、抗体的类别

l 单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）

识别单一抗原表位的抗体；通常由杂交瘤细胞生产；

特异性高、批间一致性好，适用于定量实验（如ELISA、流式细胞术）；

l 多克隆抗体（Polyclonal antibody，pAb）

识别多个抗原表位的抗体；通常以免疫原直接免疫动物，然后收集血清；

通常亲和力高、灵敏度好，适用于检测低丰度蛋白；

图2 杂交瘤技术流程（doi: 10.1186/s43141-021-00264-6）

（一）一抗和二抗的区别

查找一抗

以某品牌为示例，当研究LCK蛋白相关功能时，我们要购买Anti-LCK抗体，分别对应有pAb和mAb。如果检测样本为人和小鼠来源的，则可以考虑购买货号PB0850。如果样本为人且需检测特定表位变化（磷酸化、糖基化等），则应选购单抗货号BM5379。

注：磷酸化验证时，请留意对应的检测位点，确定与上游通路相关。

查找二抗

基于实验目的，选择相应的二抗（酶标二抗、荧光二抗标记、生物素标记、未标记等）。如果进行的是Western blot（WB）实验，则一般选择辣根过氧化物酶标（HRP）标记的二抗。如果购买一抗为Rabbit来源的IgG，则选择Anti-Rabbit的抗体，如Boster的HRP二抗名称为HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)，二抗宿主是山羊。

（二）克隆号

克隆号是指单克隆抗体的来源标识，每一种克隆号代表一组从单个B细胞克隆分离出的抗体。由于这些抗体来自同一个B细胞克隆，它们对目标抗原的识别具有完全相同的特异性和亲和力。而同一抗原的不同表位可能被不同克隆号的抗体识别。

注：克隆号决定了抗体以什么方式/亲和力识别靶标蛋白。若选择错误将伴随特异性差、背景信号高等问题。

示例

某实验室检测CD3刺激后的LCK磷酸化，使用Anti-LCK p-Y394（Clone X），WB始终无信号。更换另一厂家同一位点抗体（Clone Y）后信号清晰。原因：Clone X的表位位于磷酸化位点附近但不依赖磷酸化，识别的是空间构象；Clone Y则是磷酸化特异性表位。前者在变性WB中表位破坏，后者因磷酸化基团暴露而稳定。

三、抗体的应用场景

（一）蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）

利用聚丙烯酰胺凝胶的孔状结构，以SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白带上负电荷，在电场作用下，依据分子量大小使样品中的蛋白质分开。通过转膜，蛋白质转移到特定的固相支撑物上（PVDF膜或NC膜）。最后，对膜上的蛋白进行一抗、二抗的孵育，加入酶的底物（常见ECL发光液）进行蛋白显影。通过此方法可对样品中的特定蛋白质进行半定量，由此得知蛋白在细胞内的表达水平。

范围：检测蛋白质的表达和修饰，如磷酸化、糖基化等；检测蛋白质之间的相互作用；

样本类型：组织、细胞等固体样本的裂解液

（二）免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）、免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation，co-IP）和染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）

免疫沉淀是利用固定有靶标抗体的磁珠，将溶液样本内的特定蛋白质富集分离的技术。通常用于检测某一蛋白的表达情况。

免疫共沉淀是通过抗体与已知蛋白的结合，捕获整个已知蛋白的复合物，从而研究复合物中与已知蛋白存在相互作用的蛋白。研究目的是发现与已知蛋白存在相互作用的蛋白。

染色质免疫共沉淀是用来研究蛋白质与DNA是否互作，利用抗原抗体的结合反应，将目的蛋白以及其结合的DNA片段沉淀下来。该技术常用来检测转录因子结合位点。

（三）酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

ELISA是一种基于抗原抗体的特异性结合反应，通过酶标记物催化底物产生可检测信号，从而对样本中目标抗原或抗体进行定性与定量分析的免疫学技术。通常分为四种类型：直接法、间接法、夹心法和竞争法。

范围：抗原或抗体的定性或定量分析；低丰度蛋白的检测；大批量样本筛查；

样本类型：培养上清、血清、血浆等液体样本

（四）免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）以及免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）

IHC、IF、ICC都是利用抗原抗体结合，对靶标进行显色的实验技术。如果报告标签是酶促的，则为免疫化学；如果是荧光的，则为免疫荧光。按照标签类型分为：荧光类包括IF（适用于细胞和组织）；酶促类包括IHC（适用于组织切片）和ICC（适用于细胞爬片或细胞）。

范围：确定蛋白在细胞中的定位；观察组织分布模式；蛋白共定位分析；

样本类型：组织切片、细胞爬片

（五）流式细胞术（Flow Cytometry，FC/FCM）

高压驱动的液流中细胞呈现单个排列的方式通过，在此基础上利用激光照射，产生的荧光信号可以被多个信号接收器接收，激光束直线方向上接收的前向角散射光信号，与激光束垂直方向上接收的侧向角散射光信号，经过光电系统的信号转化，最终呈现信号的强弱。

范围：细胞周期；细胞凋亡；细胞活性；细胞分选；细胞表面标志物分析等；

样本类型：单细胞悬液